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• 1.DNA测序的原理是什么？步骤如何？ABI 3730XL测序的准确程度如何？

  更新时间：2023-03-01

  DNA测序的原理是末端终止法。具体步骤如下：

  1.定量：对样品及引物进行定量。

  2.测序反应：在反应体系中加入已定量的模板和引物，BigDye等试剂，PCR仪上完成测序反应。

  3.读取数据：根据荧光的不同，读取被测样品的碱基序列。ABI公司目前承诺测序结果在800bp以内准确率为98.5%。

• 2.为什么在测序报告上找不到我的引物序列？

  更新时间：2023-03-01

  1. 如果您提供的样品是PCR产物，在测序报告上找不到您的引物是正常的。这是因为测序反应是通过对被荧光标记的ddNTP的读取而获得基因序列的，而测序引物由于没有荧光标记，因此自然在测序结果中就不会被识别。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<800bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到您的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间还有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。

  2. 如果您提供的样品是质粒或菌液，PCR产物用载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时,请尝试在互补链上寻找您的引物序列。

  3. 当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时测序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引物完整序列。

   4. 有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序列完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。

• 3.我的引物做PCR效果很好，为什么用于测序总得不到好的结果？

  更新时间：2023-03-01

  用于测序的引物比用作PCR反应的引物要求高，以下是不适合用于测序反应的引物类型：

  
  

  1.不纯的引物：用于测序的引物纯度要求很高，合成中的小片段会直接造成严重的背景峰，因此用于测序的引物序列长度一般在24个碱基之内，因为过长的引物纯度不易保证。

  2.简并引物、随机引物和有特殊标记的引物。

• 4.NGS接头，由百力格进行退火时，退火效率大概是多少，退火交付的溶度是多少？退火后需要稀释的话，可以提供稀释的buffer吗？

  更新时间：2025-10-24

  退火效率没有量化数值，可以做琼脂糖凝胶检测，短接头接近100%退火。 交付浓度可以定制，我们成品是15uM。可以提供稀释用的退火buffer。

• 5.百力格的成品接头5ul一个反应，如果是低投入量建库，例如1ng，也是加5ul吗？

  更新时间：2025-10-24

  1. 50ng投入量以上，直接加5ul一个反应

  2. 低于50ng建库，接头要做相应的稀释。1ng的投入量，建库接头需要稀释5-15倍再加入5ul

  
  

• 6.接头质检全检还是抽检？

  更新时间：2025-10-24

  合成的index 引物每条都有MS和HPLC质检，接头退火会做退火效率检查

• 7.百力格成品接头的污染率是多少？拆分率是多少？

  更新时间：2025-10-24

  污染率万分之一以下；拆分率97.9%（10nt，允许1错配）

• 8.酶切建库试剂盒有没有单独的酶切步骤的模块？

  更新时间：2025-10-24

  没有单独的酶切步骤的模块，酶切和修复一体进行

• 9.使用酶切建库试剂盒做gDNA，FFPE样本建库，有推荐的酶切时间吗？

  更新时间：2025-10-24

  gDNA切10min；FFPE DNA切2-8min，降解程度越高，酶切时间越短。重度降解都是小片段的样本建议不用酶切打断，直接用百力格通用建库试剂盒修复建库

• 10.酶切试建库剂盒会引入假阳性吗？可否耐受样本中含te？

  更新时间：2025-10-24

  1. 理论上酶切和机械打断建库都会引起嵌合体，可能会导致假阳性。百力格酶切建库试剂盒通过优化buffer和酶体系，有着极低的嵌合体率。且嵌合体可以通过下游的生信分析流程进行过滤。

  2. 耐受样本中含te。

  
  

• 11.接头序列中 硫代修饰的作用是什么？

  更新时间：2025-10-24

  硫代修饰是为了防降解、阻止核酸酶消化，一般在最后一个碱基加一个硫代。

  
  

• 12.全长接头与截短型接头的区别是什么？

  更新时间：2025-10-31

  全长接头：1）包含测序时所需要的全部序列，可不进行PCR反应而直接上机测序。2）可用于构建PCR-Free的文库，PCR-free文库可以降低PCR扩增偏好性、错误率以及序列重复。

  截短型接头：1）需要通过PCR扩增形式形成完整接头才能上机测序。2）连接效率，建库产量高于全长接头。3）接头二聚体片段较小，可以通过磁珠纯化进行有效的去除。

  
  

• 13.UMI接头的作用？

  更新时间：2025-10-31

  可实现双端UMI校正，提高低频突变检测的灵敏度和特异性。