引探/修饰

• 1.纯化方式及其详细说明

  更新时间：2023-02-28

  脱盐(DSL) 合成完成的寡核苷酸通过高纯氨气混合水蒸汽,在高温高压下将连接在CPG上的引物切下来后通过普通相层析柱进行层析除盐。Cartrige纯化 Cartrige纯化是通过反相净化介质 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化，纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较，Cartrige是一种有效并且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶，能够很好的吸附DNA，并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。

  
  

  PAGE纯化 PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对引物DNA进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于90%，对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效。

  
  

  HPLC纯化 HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对引物DNA进行纯化。该方法用于分离纯化或分析时能达到很高的纯度和灵敏度。在引物DNA的分析和纯化中，常用的是反相（reverse-phase）HPLC。reverse phase HPLC：纯度大于90%； HPLC纯化主要用于修饰引物的纯化。该法的缺点是成本较高，批量生产效率不高。

• 2.核酸换算

  更新时间：2023-03-01

  1. 摩尔数与质量 

  1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol     

  1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol     

  1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28 pmol     

  1 μg lambda phage DNA (48,502bp) = 0.03 pmol     

  1 μg M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.21 pmol     

  1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol     

  1 μg pUC18/19 DNA (2,686bp) = 0.57 pmol    

  1 pmol 1,000bp DNA = 0.66 μg

  1 pmol M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 4.78 μg

  1 pmol SV40 DNA (5,243bp) = 3.46 μg

  1 pmol pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.77 μg

  1 pmol pBR322 DNA (4,361bp) = 2.88 μg

  1 pmol lambda phage DNA (48,502bp) = 32.01 μg

  1 pmol FX174 DNA (5,386bp) = 3.54 μg

  
  

  2.光吸收值与浓度

  1 OD260 dsDNA = 50  μg/ml

  1 OD260 ssDNA = 33  μg/ml

  1 OD260 ssRNA = 40  μg/ml

  
  

  3.分子量

  1个脱氧核糖核酸碱基的平均分子量为333 Daltons

  1个核糖核酸碱基的平均分子量为340 Daltons

  
  

  4.核酸末端浓度

  线性DNA：pmol ends = pmol DNA ′ (number of cuts ′ 2 + 2)

  环状DNA：pmol ends = pmol DNA ′ number of cuts ′ 2

  1 μg 线性1,000bp DNA = 3.04 pmol ends     

  1 μg 线性 FX174 DNA (5,386bp) = 0.56 pmol ends

  1 μg 线性 pUC18/19 DNA (2,686bp) = 1.14 pmol ends     

  1 μg 线性 SV40 DNA (5,243bp) = 0.58 pmol ends

  1 μg 线性 pBR322 DNA (4,361bp) = 0.7 pmol ends     

  1 μg 线性 lambda phage DNA (48,502bp) = 0.06 pmol ends

  1 μg 线性 M13mp18/19 DNA (7.249bp) = 0.42 pmol ends

  
  

  
  

• 3.如何测定引物的OD值？

  更新时间：2023-02-28

  用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

• 4.核苷酸的换算

  更新时间：2023-03-01

  1.分子量

  MW (Da) = 333 ′ N (number of bases)

  
  

  2.浓度

  C (mmol/L or pmol/ml) = OD260 / (0.01 ′ N) C (ng/ml) = OD260 ′ MW / (0.01 ′ N)

  注：MW —— molecular weight；N —— number of bases；OD260 —— absorbance at 260 nm

  
  

  3.双链DNA与寡核苷酸的熔点：

  短于20bp的双链寡核苷酸：Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

  长于20bp的双链寡核苷酸： Tm = 81.5 + 16.6 ( lg[J+] ) + 0.41 (%GC) –(600/N) 

  注： N —— 引物的长度(以碱基数计算)；J+ —— 单价阳离子浓度

  
  

  4.DNA与表达蛋白之间分子量换算

  1 kb DNA = 333 amino acid ≈ 3.7 ′ 104 Da

  10,000 Da Protein ≈ 270 bp DNA     30,000 Da Protein ≈ 810 bp DNA

  50,000 Da Protein ≈ 1350 bp DNA     100,000 Da Protein ≈ 2700 bp DNA

• 5.怎样溶解引物？

  更新时间：2023-02-28

  我们的的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。

• 6.合成的引物应如何保存?

  更新时间：2023-02-28

  没有溶解的引物/探针可以在-20℃下保存至少24个月，溶解好的引物/探针可以事先稀释为 100uM 的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少18个月以上(反复多次冻融会降低使用寿命)。使用前，将浓溶液稀释成工作液(10pmol/ul或20pmol/ul)后进行实验。

  
  

• 7.如何检测引物的纯度？

  更新时间：2023-02-28

  实验室方便的做法是使用加有7M尿素的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的胶，>60个碱基的引物用12%的胶）取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃，2mins）。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时）剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的（有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，这是引物二级结构条带）。

• 8.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?

  更新时间：2023-02-28

  没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化的费用。

• 9.定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8，引物的纯度合格吗?

  更新时间：2023-02-28

  由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的引物的A260/A280比值也不同， 例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

• 10.使用3%的Agarose凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?

  更新时间：2023-02-28

  对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带，更无法用Agarose电泳进行定量了。

• 11.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?

  更新时间：2023-02-28

  不能。因为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

• 12.引物在常温下运输，会降解吗？

  更新时间：2023-03-01

  不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

• 13.合成的荧光标记探针应如何保存?

  更新时间：2023-03-01

  1) 荧光探针必须避光保存。

  2)干品请于-20℃保存。

  3) 强烈建议用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定，保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/ul的储备液，分装成几份 (避免反复冻融)，于-20℃保存。使用前，将配制好的储备液稀释成工作液 (10 pmol/ul或20 pmol/ul)，剩余部分于-20℃保存。

• 14.电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置?

  更新时间：2023-03-01

  1) A、G、C、T的组份不同，电泳速度不同；

  2) DNA的立体结构不同，电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。

• 15.PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办?

  更新时间：2023-03-01

  1) 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，会得到正确的结果。

  2) 如果挑选2 ~ 3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。

• 16.进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办?

  更新时间：2023-03-01

  1) 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。

  2) 我们可以免费重新合成引物。

  3) 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。

• 17.进行反义核酸实验时，是否要对DNA链全部进行S代修饰，除了S代外，还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性?

  更新时间：2023-03-01

  DNA经S代修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代，的确能增加DNA的稳定性，但会降低其Tm值，也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此，科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键Phosphorothioated Bonds)，这样既能增加DNA的稳定性，又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内，为增强稳定性，还是将整条链S代效果更好。

• 18.FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别?

  更新时间：2023-03-01

  它们皆是荧光素标记 (Fluorescein)，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。

• 19.何谓分子信标 (Molecular Probes)？与普通的双标记探针 (如TaqMan探针)相比，在使用上有什么特殊性？

  更新时间：2023-03-01

  Molecular Probes是一类特殊的双标记探针，通常状态下，其两末端互补配对，形成茎-环结构 (发卡环结构)，发卡环结构迫使分别连在两末端的报告基团与淬灭基团紧密邻近 (此时检测不到荧光)，而一旦杂交到靶序列上，则报告基团与淬灭基团分开，Molecular Probes变得明亮起来，可检测到荧光。由于发卡环结构的存在，探针对靶序列检测的特异性增强，相对于普通的双标记探针 (如TaqMan探针)，Molecular Probes对SNP有更强的识别能力，能区分序列上仅相差一个碱基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP检测。此外，Molecular Probes也应用于活体细胞内的mRNA杂交、RNA加工、及转录过程的时时监测研究等。 

• 20.超级淬灭探针比常规BHQ探针有哪些优势？

  更新时间：2025-10-31

  信噪比提升、Ct值减少 、高GC序列良好适用性 、更低本底，更高相对荧光强度

• 21.MGB探针相比常规BHQ探针有哪些特点？

  更新时间：2025-10-31

  可提高TM值约15°C，适用于AT 富集序列，可设计较短序列，与序列的结合能力更强

• 22.订购表中检验报告中H+M+F+C分别代表什么含义？

  更新时间：2025-10-31

  H代表HPLC报告，M代表MASS报告，F代表全波长扫描报告，C代表浓度报告

• 23.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？

  更新时间：2025-10-31

  通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。