PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。
1) 引物和模板是否配对，同源性有多大?
2) 引物本身是否有立体结构.
3) PCR反应用试剂是否能正常工作?
4) PCR仪是否工作正常?5) PCR反应条件是否合适?
如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。
PCR/qPCR
-
1.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?
更新时间：2023-02-28
-
2.用退火缓冲液(10mM Tris, pH 7.5 - 8.0, 50mM NaCl, 1mM 13.2OD的引物可以多少做次PCR反应？
更新时间：2023-02-28
一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。 EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃ 2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。
-
3.2OD的引物可以多少做次PCR反应？
更新时间：2023-03-01
一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。
-
4.平端的PCR产物难以克隆，为什么?
更新时间：2023-03-01
由于一般的PCR用引物的5′末端都没有磷酸基团，因此，扩增后的PCR产物的5′末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对PCR产物的5′端进行磷酸 (PO4修饰) 化处理。
-
5.淬灭基团为TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同?
更新时间：2023-03-01
由淬灭基团TAMRA、Eclipse或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针(Hydrolysis Probes)，或称"TaqMan"探针，用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同(见下图)，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下：
1) TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底 (Background)相对较高。而Eclipse及BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。
2) 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱迭盖(Overlapping),也即报告基团的荧光光谱应与淬灭基团的吸收光谱相交搭。对比TAMRA、Eclipse及BHQ系列染料的吸收光谱，可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类比较少；而Eclipse则具有更宽的吸收范围(390 nm-625 nm)，可淬灭的报告基团种类很多，如FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多 (象Cy3、Cy5等的淬灭效果都很好)。因此可由Eclipse或BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR(Multiplexing PCR)。
-
6.TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则?
更新时间：2023-03-01
1) 探针应位于两引物之间；
2) 探针中碱基G、C的含量应在20%～80%之间；
3) 避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”；
4) 碱基G不要出现在5’末端；
5) 探针的Tm值要比引物的Tm值高8～10℃，应在68～70℃之间；
6) 探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3’末端应加磷酸基封阻，以防探针在PCR反应过程中延伸。
-
7.如何确认模板中是否含有抑制物质?
更新时间：2025-10-31
使用较高浓度的模板按3～4个梯度稀释，并使用其进行Real Time RT-PCR反应或Real Time PCR反应。如果无抑制物质存在，得到的Ct值会依存模板浓度的变化而变化；如果有抑制物质存在，就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。 抑制物的影响或可通过稀释样本消除
-
8.qPCR扩增效率低
更新时间：2025-10-31
1)反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
2)反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
3)反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
4)引物设计的评分不高，容易形成二级结构或是不易退火，重新设计新的引物进行实验。
5)试剂未充分混匀或移液误差，建议重复实验。
6)qPCR试剂的影响：试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导致Taq酶活力未达最强。
-
9.qPCR扩增效率较高？例如>110%
更新时间：2025-10-31
1）非特异性扩增，建议降低引物浓度，改变退火温度或重新设计引物
2）引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物
3）模板稀释错误，建议重新制备梯度稀释样本
-
10.Ct值过大的原因
更新时间：2025-10-31
可能为模板浓度太低、体系有抑制和扩增效率低，建议适当提高模板浓度，优化反应条件（见扩增效率低），或尝试更换试剂。
-
11.Ct值过小的原因
更新时间：2025-10-31
可能为模板浓度过高，体系内有污染，引物形成二聚体。建议适当增加稀释比例，更换所有试剂杜绝污染，重新设计不容易形成二聚体或非特性扩增的引物序列。
-
12.扩增曲线的荧光信号值低的原因是什么?
更新时间：2025-10-31
扩增曲线存在问题时，首先应确认基线校正或ROX校正前的原始曲线，扩增曲线的荧光信号值低多数是由于背景荧光信号值过高造成的。
使用SYBR Green染料法进行检测时，背景荧光信号偏高大多数是由于模板量过高，染料嵌入到初始模板DNA中发出荧光造成的。
使用探针法进行检测时，背景荧光信号偏高大多是由于设计的探针参数评分不高，使淬灭基团的淬灭作用不充分、报告基团和淬灭基团的搭配不合理等；探针的荧光标记效率低或出现降解等也是影响之一。
